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El tamaño de las preguntas y la Esclerosis Lateral Amiotrófica

Juan García Ruiz
October 31st, 2019 · 10 min read
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Desde que nace, el ser humano quiere entender. Con la aparición del lenguaje, las dudas comienzan a manifestarse a través de preguntas – qué es esto, quién es ése, la vida tiene algún sentido, y otras muchas cuestiones que podría formular un niño de tres años – agilizando así la comprensión del mundo. La curiosidad crece junto al ser humano, y la capacidad de hacer preguntas se afina. Uno acaba entendiendo que es más probable obtener una respuesta preguntando qué es esto o para qué sirve lo otro que preguntando sobre el sentido de las cosas.

En la ciencia ocurre algo similar. Preguntar sobre la cura de la Esclerosis Lateral Amiotrófica es más ambicioso pero menos fructífero que preguntar sobre los componentes moleculares relacionados con la etiología de la enfermedad, sus funciones y sus interacciones. Partir de una gran pregunta es necesario, pero es igualmente esencial responder a las pequeñas preguntas derivadas de la primera con el fin de dar forma a una gran respuesta.

La gran pregunta de partida da título al artículo precedente: ¿Qué es la Esclerosis Lateral Amiotrófica?. El objetivo principal del presente artículo es formular preguntas más pequeñas cuyas respuestas están a nuestro alcance, y mostrar las relaciones entre éstas y la pregunta de partida. Un objetivo secundario es ilustrar que es posible aprender más sobre un tema a partir de pequeñas respuestas que a partir de las ambiciosas soluciones que ciertos medios tratan de ofrecer para satisfacer rápidamente la ansiedad de conocimiento.

En otras palabras, este artículo pretende explorar la proteína TDP-43, relacionada con la Esclerosis Lateral Amiotrófica. Permítanse unas últimas insistencias: sobre la necesidad de no perder de vista la pregunta principal en ningún momento, y sobre la necesidad de una lectura escéptica y crítica ante las grandes preguntas (y sobre todo, ante las grandes respuestas).

El carnet de identidad de la proteína TDP-43

Como se explicó en el anterior artículo, la proteína TDP-43 está íntimamente relacionada con la ELA. La comprensión de la proteína (en términos de estructura, función, localización celular, presencia en diferentes organismos) puede aportar algo de luz a la aparición de la patología. En primer lugar, no hay que olvidar que todos poseemos esta proteína. En este punto, una pregunta completamente justificada es: ¿por qué no todos tenemos ELA? Todos poseemos la proteína en su estado salvaje (sin mutaciones), pero la patología se relaciona con una forma mutante de la misma. Es decir, la Esclerosis Lateral Amiotrófica está asociada a ciertas modificaciones genéticas del ADN que codifica esta proteína (ver Figura 1).

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Figura 1. Representación esquemática de una célula. El ADN contiene una mutación en su secuencia de nucleótidos (cruz roja). Esta mutación es transcrita, dando lugar a una molécula de ARN mutante, y ésta es a su vez traducida en una proteína que presenta igualmente la mutación. Esto es lo que ocurre en los casos de Esclerosis Lateral Amiotrófica: el gen que codifica la proteína TDP-43 da lugar a una forma aberrante de la misma. La función natural de la proteína es perturbada, ocasionando las conocidas consecuencias de la enfermedad: muerte celular (al tratarse de neuronas hablamos de neurodegeneración).

En otras palabras, los problemas comienzan a aparecer en un contexto de mutación genética. No obstante, es imprescindible conocer la estructura y el funcionamiento normal de la proteína para comprender la relación entre la estructura mutada y las funciones aberrantes (y en última instancia, la neurodegeneración).

Esta proteína, codificada por el gen TARDBP, tiene dos isoformas principales (es decir, un mismo ADN puede dar lugar dos proteínas diferentes en función de diversos factores que no se tratarán en el presente artículo). En este artículo nos centraremos en la isoforma 1, ya que según la base de datos UniProtKB es la versión canónica de la proteína.

TDP-43 es una proteína compuesta por 414 aminoácidos (piezas elementales que componen las proteínas, como los ladrillos componen una casa) y tiene una masa de 44.740 daltons (el dalton es la unidad utilizada para expresar el peso de los átomos y de las moléculas como las proteínas, de la misma forma que utilizamos el kilogramo para expresar el peso del ser humano). En condiciones normales, esta proteína se encuentra en el núcleo celular, y tiene múltiples funciones relacionadas con la biogénesis (creación) y el procesamiento del ARN.

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Figura 2. Localización subcelular de la proteína TDP-43. Imagen extraida de UniProtKB (2002)

Fotos de carnet de la proteína TDP-43

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Figura 3. Representación tridimensional de la proteína TDP-43. Imagen extraida de UniProt (2018)
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Figura 4. Representación esquemática bidimensional de los 414 aminoácidos de la proteína TDP-43 y de sus dominios proteicos (en azul y verde). Los dominios proteicos son secuencias de más de 20 aminoácidos conservadas a lo largo de la evolución. Los dominios pueden ser considerados como unidades independientes de las proteínas, poseen funciones especificas y pueden estar presentes diferentes proteínas de una misma especie o en proteínas de especies diferentes. Continuando con la metáfora del ladrillo para hacer referencia a los aminoácidos en una proteína, los dominios son estructuras formadas por ladrillos con una función particular y diferenciada (por ejemplo, constituirían un _dominio_ los ladrillos que forman un puente, un pozo o el tejado de una casa). Por esta razón, los dominios son secuencias de aminoácidos que pueden considerarse independientes de la proteína y de la especie. Su presencia en las proteínas se ha visto favorecida por la selección natural, y evolucionan de forma independiente. Imagen extraída de InterPro (s. f.) (simplificada y modificada). Ademas de los dominios (representados en la imagen) TDP-43 posee dos motivos proteicos. Los motivos, tal y como los dominios, son regiones conservadas a lo largo de la evolución pero de tamaño menor, normalmente de menos de veinte aminoácidos. En el caso de TDP-43 un primer motivo entre las posiciones 82 y 98 esta relacionado con la migración de la proteína al núcleo. El segundo motivo se encuentra entre los aminoácidos 239 y 250 y esta asociado a la exportación de la proteína desde el núcleo hasta el citoplasma.

Hábitat natural de la proteína TDP-43

TDP-43 es una proteína presente en el ser humano así como en otras especies como el gibón de mejillas blancas (primate hominoideo), el orangután de Sumatra, el narval (cetáceo dentado) o el diablo de Tasmania (Altschul et al., 1997). Esta proteína implicada en la regulación genética se expresa de forma constitutiva (en todos los tejidos) aunque no en las mismas proporciones:

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Figura 5. Expresión diferencial de la proteína TDP43 en función del tejido. La cuantificación del ARNm de una proteína es una buena medida de la expresión genética, ya que las moléculas de ARNm que han sido transcritas a partir de un gen dado (ADN) son normalmente traducidas finalmente en proteína. La presencia de ARNm es un indicador del nivel de transcripción, y este a su vez correlaciona positivamente con la expresión genética. Imagen extraída de The Human Protein Atlas. (s.f.). Texto traducido al español.

En resumen, la proteína TDP-43 se encuentra en diversas especies, y está presente en la mayoría de los tejidos estudiados (tejido endocrino, pulmones, tejido muscular…). Tan solo en los ojos y en la sangre es posible encontrar el ARNm que codifica la proteína, pero no el producto final (TDP-43). La expresión de la proteína en el tejido nervioso (representado como Cerebro) es coherente con la hipótesis que propone que una expresión aberrante de la proteína está al origen de la degeneración neuronal de la ELA.

Actividad profesional de la proteína TDP-43

TDP-43 está implicada en la generación y el procesamiento del ARN. Los ARN regulados por TDP-43 son diversos: ARN mensajeros que codifican proteínas implicadas en la supervivencia neuronal, por ejemplo. Esta proteína es capaz de unirse a las repeticiones de dos ribonucleótidos (ladrillos del ARN): uracilo (U) y guanina (G). Esto es posible gracias a la presencia de los dos dominios proteicos mencionados arriba: RRM1 y RRM2. Entre las funciones del ARN reguladas por TDP-43 se encuentra la maduración del mismo (etapa esencial para su traducción en proteínas) o su estabilización (controlando la longitud de la extremidad poliadenilada del ARN, que es una de las características de los ARN maduros). En casos de estrés oxidativo, la proteína TDP-43 forma complejos compuestos constituidos de otras TDP-43 y ARN: estos agregados reciben el nombre de gránulos de estrés (GS según su sigla en inglés) y permiten la supervivencia de las células. Asimismo, TDP-43 contribuye a la periodicidad de los ritmos circadianos estabilizando las proteínas CRY1 y CRY2 indirectamente.

La base de datos UniProtKB reúne información proveniente de diferentes fuentes relativa a las funciones moleculares y los procesos biológicos en los que TDP-43 está implicada. A continuación se recogen algunos de ellos (listas no exhaustivas):

Funciones moleculares de TDP-43:
  • Capacidad de interactuar con el ADN en estado de doble hélice: TDP-43 es capaz de favorecer la interacción de la proteína ARN polimerasa II con el ADN, contribuyendo a la regulación (activación o inhibición) de la transcripción en ARN mensajero (rol de factor de transcripción). Fuente: BHF-UCL, ProtInc y Ensembl.
  • Capacidad de interactuar con el ARN. Fuente: BHF-UCL.
  • Capacidad de interactuar con proteínas idénticas a ella. Fuente: IntAct.
Procesos biológicos relacionados con TDP-43:
  • Procesamiento del ARNm. Fuente: UniProtKB.
  • Regulación negativa de la expresión genética. Fuente: CACAO.
  • Regulación negativa de la fosforilación de proteínas. Fuente: CACAO.
  • Organización de la membrana nuclear interna. Fuente: CACAO.
  • Regulación positiva de la secreción de insulina: TDP-43 puede favorecer la secreción de insulina, una hormona peptídica necesaria para el mantenimiento de la glicemia (azúcar en sangre) en un rango normal. Fuente: Ensembl
  • Regulación positiva de la importación de proteínas al núcleo celular: TDP-43 favorece la migración de proteínas al interior del núcleo celular. Esto se relaciona con las funciones moleculares descritas: interacción con el ADN, con el ARN y rol de factor de transcripción. Fuente: Ensembl.
  • Regulación de la apoptosis: la apoptosis es la muerte celular programada por la célula (en contextos de estrés celular, por ejemplo). Fuente: CACAO.
  • Regulación del ritmo circadiano. Fuente: Ensembl.
  • Regulación de la estabilización de proteínas. Fuente: UniProtKB.

Cuando no todo va bien: la proteína mutante

Las mutaciones genéticas que pueden dar lugar a variantes naturales (pero patológicos) de la proteína TDP-43 son diversas. Una característica común de estas mutaciones es que todas consisten en la sustitución de un solo nucleótido por otro en la secuencia de ADN (ver Figura 1), traduciéndose en la modificación puntual de uno de los 414 aminoácidos (ladrillos de las proteínas). Los aminoácidos afectados identificados hoy en día en los casos de ELA están comprendidos entre la posición 169 y la 393 (UniProtKB, 2002).

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Figura 6. A la izquierda, representación esquemática de los 414 aminoácidos de la proteína TDP-43. Los diferentes dominios identificados han sido representados en sus posiciones correspondientes (en verde y en rojo). Las zonas de baja complejidad (LCR por sus siglas en ingles: low complexity domain) han sido representadas en azul. A la derecha, tabla resumiendo la información precedente con el detalle de la posición de las cada dominio. Al margen de la tabla, mutaciones observadas en diferentes casos de ELA junto a cada región afectada. La figura 6 muestra una gran concentración de mutaciones en las regiones de baja complejidad. Por tanto, es posible deducir que la perturbación de la función normal (en ausencia de mutación) de las regiones LCR se asocia con la Esclerosis Lateral Amiotrófica. Imagen extraída de Pfam (s.f.) (simplificada y modificada)

Nota: las mutaciones en los aminoácidos 298 y 379 han sido representadas dos veces, ya que afectan a dos regiones que se solapan: LCR (271-305) y (297-313) en el caso de la mutación 298 y (367-379) y (374-403) en el caso de la mutación 379. Ciertas mutaciones relacionadas con la ELA no han sido representadas, ya que afectan a regiones de la proteína que no pertenecen a ningún dominio, y con el fin de simplificar la imagen estas zonas han sido descartadas.

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Figura 7. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de la proteína TDP-43 contra la isoforma 2 de tamaño más reducido. Los aminoácidos de ambas secuencias han sido representados con el código de una sola letra. Para más información sobre el código y la estructura de los aminoácidos, es posible visitar el siguiente enlace: https://proteinstructures.com/Structure/Structure/amino-acids.html (Structural Bioinformatics, s.f.). La secuencia superior (del aminoácido 1 al 414) corresponde a la estructura linear de la proteína en su estado natural (isoforma 1). La secuencia inferior (del aminoácido 1 al 298) corresponde a la isoforma 2. Tal y como muestra la imagen, hay una correspondencia casi perfecta entre ambas isoformas desde el aminoácido 129 de la isoforma 1 y el aminoácido 13 de la isoforma 2 hasta el final de la cadena. Al principio de ambas secuencias hay otro bloque constituido por aminoácidos idénticos o similares (simbolizados con doble punto). Los primeros 103 aminoácidos son específicos de la isoforma 1. En otras palabras, las isoformas de la proteína TDP-43 se diferencian en el tamaño de la cadena, siendo la 1 superior a la 2 y encontrándose el fragmento extra al principio de la cadena. Los aminoácidos correspondientes a los dominios proteicos RRM1 y 2 han sido representados en amarillo. Los aminoácidos azules representan los lugares puntuales en los que se han identificado mutaciones relacionadas con la ELA.

En resumen, a partir de los casos de mutación de la proteína TDP-43 es posible sospechar que las regiones de baja complejidad (zonas más frecuentemente mutadas) deben jugar un papel importante en el funcionamiento normal de las células, y que su perturbación puede tener consecuencias negativas para las mismas.

Los efectos de la mutación

Recordemos que la proteína TDP-43 posee dominios, motivos proteicos y regiones de baja complejidad, y que sus funciones están relacionadas con la regulación de la expresión genética. Las mutaciones relacionadas con el ELA afectan principalmente a las regiones de baja complejidad. ¿De qué manera pueden las mutaciones del ADN acarrear problemas funcionales para la célula? Una posible explicación en el caso de la ELA podría ser el fenómeno conocido como separación de fase (LLPS o liquid-liquid phase separation, en inglés).

La separación de fase

De la misma forma que el agua puede encontrarse en estado líquido, gaseoso (vapor) y sólido (hielo), las proteínas pueden adoptar un estado líquido cuando se encuentran disueltas en el espacio celular (también líquido), o un estado sólido más estático. El estado de liquidez de las proteínas depende de su composición en aminoácidos: existen 20 ladrillos diferentes, todos ellos con propiedades físicas y químicas diferentes. Así, las proteínas con regiones de baja complejidad (zonas en las que abundan los aminoácidos glicina, glutamina, alanina y prolina), pueden tener estructuras tridimensionales muy diversas, ser muy dinámicas e interactuar con otras proteínas del mismo tipo, dando lugar a una agregación de proteínas importante (Wolozin & Ivanov, 2019). Cuando las proteínas con regiones de baja complejidad en estado líquido comienzan a interactuar entre sí, es posible observar la formación de unas gotas proteicas relativamente separadas del resto del medio celular (de la misma forma que el aceite, en estado líquido, se separa del agua, también en estado líquido). Por ello este fenómeno es conocido como separación de fase líquido-líquido.

En ocasiones, cuando las moléculas de ARN interactúan con ciertas proteínas como TDP-43, y a su vez éstas interactúan con otras proteínas TDP-43, es posible que tenga lugar una transición de estado: las proteínas pueden pasar del estado líquido a un estado semi-sólido próximo a un gel (Wolozin & Ivanov, 2019). Estas estructuras compuestas por proteínas y ARN son conocidas como gránulos de estrés. Los gránulos de estrés son elementos celulares muy importantes, ya que sirven para facilitar ciertos procesos como la expresión genética: estos gránulos no solo aproximan las proteínas TDP-43 entre sí, sino que además interaccionan con otras proteínas importantes para la expresión, y con el ARN. En otras palabras, los gránulos de estrés sirven para reunir en lugares puntuales de la célula todo el material necesario para la expresión genética. De esta forma, las moléculas que conforman los gránulos de estrés pueden interactuar en cuestión de segundos en lugar de minutos u horas (Bergeron-Sandoval, Safaee & Michnick, 2016).

Las interacciones entre las regiones de baja complejidad son débiles, lo que permite que los gránulos de estrés se formen y se deformen constantemente. Las transiciones de estado entre las proteínas y sus interacciones con el ARNm son una parte esencial de la regulación del metabolismo del ARN (Wolozin & Ivanov, 2019).

El papel de las mutaciones

Las mutaciones mencionadas más arriba relacionadas con la ELA afectan principalmente a las regiones de baja complejidad. Estas regiones capaces de formar y deformar agregados proteicos son necesarias para el metabolismo del ARN. La literatura habla además de una relación entre la formación de agregados estables de TDP-43 en el citoplasma (ver ¿Qué es la Esclerosis Lateral Amiotrófica?) y la neurodegeneración de las neuronas motoras características de la ELA. ¿Cómo se relaciona todo esto? Una posibilidad es que las mutaciones que dan lugar a la sustitución de un aminoácido por otro, de lugar a una proteína final compuesta de ladrillos con propiedades más afines que las de la proteína salvaje (no mutada). Esto tendría como consecuencia una estabilización de las interacciones entre las proteínas, favoreciendo la formación de gránulos de estrés, pero dificultando su desorganización. Dicho de otra forma, una explicación del efecto de las mutaciones sobre la célula podría ser una alteración del metabolismo del ARN (cuyo buen funcionamiento necesita la transición constante entre el estado líquido y los gránulos de estrés). La alteración del metabolismo del ARN y por lo tanto de la expresión genética en células en las que las mutaciones de TDP-43 han tenido lugar, hacen inviable la supervivencia de la célula.

Nota: la hipótesis del párrafo precedente es personal, no ha sido extraída de ningún artículo (al contrario que el resto del contenido), y no es la única posibilidad. El objetivo es ilustrar esta importante parte de la investigación: la reflexión. Sin esta etapa, las respuestas a las pequeñas preguntas no son más que informaciones aisladas y alejadas de la pregunta principal.

Si se confirmara experimentalmente la hipótesis del aumento de la estabilidad derivado de las mutaciones, podrían plantearse otras preguntas:

  • ¿Existen otras proteínas además de TDP-43 con regiones de baja complejidad capaces de desencadenar o agravar la enfermedad? (esto permitiría saber si la explicación de las regiones de baja complejidad es suficiente)
  • La ELA se caracteriza por una acumulación de TDP-43 citoplásmica y una reducción de la concentración de la misma en el núcleo celular. Sin embargo, los gránulos de estrés pueden formarse naturalmente tanto en el citoplasma como en el núcleo. ¿Qué factores intervienen en la diferencia de concentraciones en los casos de enfermedad?
  • ¿Las mutaciones descritas en los casos de ELA ocurren únicamente en el tejido nervioso? Si es así, ¿a qué podría ser debido? Si no es así, ¿cuáles son los efectos de las mutaciones en otros tejidos?

Lo que ahora sabes

La proteína TDP-43 tiene funciones importantes relacionadas con la expresión genética. Los dominios RRM1 y RRM2 presentes en la proteína permiten la interacción con el ARNm. Las regiones de baja complejidad facilitan las interacciones con otras proteínas TDP-43 y permiten la formación de gránulos de estrés, necesarios para que la cinética de la expresión de genes sea adecuada. Las mutaciones de las regiones de baja complejidad podrían estar relacionadas con la agregación aberrante (casi irreversible) de TDP-43 y con la perturbación de las funciones genéticas asociadas. Esto podría explicar la degeneración de la neurona motora característica de la ELA, y como consecuencia la atrofia muscular.

Las grandes preguntas son importantes, pero para responderlas hay que pasar por pequeñas preguntas. La relación entre éstas debe ser establecida por medio del razonamiento. Es más práctico avanzar lentamente resolviendo pequeñas incógnitas que no avanzar en absoluto tratando de responder un interrogante trascendental y ambicioso. Es importante promover el pensamiento crítico y el escepticismo ante aquellos medios que dicen haber dado con la piedra filosofal. Desde que nace, el ser humano quiere entender. Esto no quiere decir que deba conformarse con cualquier explicación.

Altschul S. F., Madden,T. L., Schäffer,A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. and Lipman, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., 25, 3389–3402.

Bergeron-Sandoval, L., Safaee, N., & Michnick, S. (2016). Mechanisms and Consequences of Macromolecular Phase Separation. Cell, 165(5), 1067–1079. Fuente

InterPro. (s.f.). InterPro. Recuperado 23 octubre, 2019. Fuente

Pfam. (s.f.). Pfam: Protein: TADBPHUMAN (Q13148). Recuperado 23 octubre, 2019. [_Fuente](https://pfam.xfam.org/protein/Q13148)

The Human Protein Atlas. (s.f.). Tissue expression of TARDBP - Summary - The Human Protein Atlas. Recuperado 23 octubre, 2019. Fuente

Structural Bioinformatics. (s.f.). The 20 Amino Acids: hydrophobic, hydrophilic, polar and charged amino acids. Recuperado 23 octubre, 2019. Fuente

UniProt. (2018, 28 febrero). SWISS-MODEL Repository | Q13148. Recuperado 1 noviembre, 2019. Fuente

UniProtKB. (2002, 27 marzo). TARDBP - TAR DNA-binding protein 43 - Homo sapiens (Human) - TARDBP gene & protein. Recuperado 23 octubre, 2019. Fuente

Wolozin, B., & Ivanov, P. (2019). Stress granules and neurodegeneration. Nature Reviews Neuroscience, 20(11), 649–666. Fuente

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